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Monitoring of the single-cell morphology for the evaluation of microbial eukaryotic bioprocesses, 2018

Technische Universität Berlin (link)

— Authors: Marbà Ardébol, A. M. —

Die Zellmorphologie wird nicht nur durch den Zellzyklus, die Alterungs- oder individuelle Eigenschaften beeinflusst, sondern auch durch Umweltbelastungen, wie sie z.B. im großen Maßstab auftreten. Die Zellmorphologie kann ein geeignete Parameter für eine in situ Messung sein, da sie sich dynamisch verändert und dabei oft mit der Zellphysiologie zusammenhängt. Um Beziehungen zwischen der Zellphysiologie und Morphologie identifizieren zu können, müssen statistisch repräsentative Datenmengen gemessen werden. Zu Berücksichtigen ist, dass das Verhalten der Zellen dabei nicht nur extrem dynamisch ist, sondern auch sehr sensibel gegenüber Umweltveränderungen. Daher können off line Messungen ungeeignet sein, kleinere Änderungen in den morphologischen Eigenschaften zu detektieren. Die Probenahme und in der Regel die Probenvorbereitung würde diese überdecken, abgesehen von einer oft nicht ausreichenden Anzahl von Daten oder eines nicht vertretbaren Aufwandes. 

Unter den Techniken, die in der Lage sind, morphologische Merkmale von Zellen zeitnah zu erfassen, sind automatisierte Bildgebungstechnologien vielversprechend, da sie über die Größe hinaus weitere Informationen über zelluläre Strukturen, Form und Zellaggregation liefern. Die photo-optische in situ Mikroskopie (ISM) und die drei-dimensionale holographische Mikroskopie (DHM) wurden in dieser Studie zur Messung der morphologischen Dynamik in eukaryontischen Kulturen auf Einzelzellbasis eingesetzt, die exemplarisch an heterotrophen Algen und Hefe untersucht wurde. 

Die intrazelluläre Konzentration der mehrfach ungesättigten Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) in der heterotrophen Alge Cryptecodinium cohnii wurde überwacht. Eine Korrelation zweiter Ordnung zwischen dem DHA-Gehalt, wie er off line chromatographisch gemessen wurde, und der Vorhersage unter Verwendung des Durchschnitts des Sauter-Durchmessers konnte gefunden werden. Eine unterschiedliche Medienzusammensetzung beeinflusste nicht nur die Zellgröße, sondern auch die Zirkularität und Phasenhomogenität der Algenzellen. Folglich wurden verschiedene Chloridionenersatzstoffe hinsichtlich des Zellwachstums und der Lipidakkumulation in C. cohnii getestet. 

Mehrkompartimenten-Reaktoren wurden eingesetzt, um den Einfluss von Gradienten, wie sie im großen Maßstab auftreten, auf die morphologische Heterogenität innerhalb von Saccharomyces cerevisiae Kulturen zu untersuchen. Insbesondere wurden die Auswirkungen von Sauerstofflimitierungen auf die Zellheterogenität untersucht. Entgegen den Erwartungen wurde die Sterolsynthese durch die oszillatorische Sauerstoffverfügbarkeit positiv beeinflusst (die Ergosterolesterkonzentrationen stiegen um 75 %), obwohl sich das mikrobielle Wachstum verlangsamte (die Biomassekonzentration war um 20 % erniedrigt). 

Darüber hinaus wurde die Knospung der Hefe mit Hilfe der ISM auf Einzelzellebene in Batchkultivierungen überwacht. Die Größenverteilung wurde während der Wachstumsphase enger, so dass die Populationshomogenität zunahm. War die Glukose verbraucht, blieb der Prozentsatz der Nicht-knospenden Zellen aufgrund einer stark verminderten Wachstumsaktivität nahezu konstant. Anhand des Anteils knospender Zellen konnte zwischen den verschiedenen Kultivierungsstadien unterschieden werden. 

Die gezeigten Methoden erwiesen sich als geeignet zur Überwachung morphologischer Eigenschaften über einen relevanten Konzentrationsbereich hinweg. Eine schnellere Partikelidentifizierung, auch von überlappenden Partikeln, und weitere Untersuchungen zu einem besseren Verständnis der Zusammenhänge zwischen Form und Zustand einer Zelle wird den Einsatz der Technologie zur Kontrolle einer Vielzahl an Bioprozessen erlauben.